Plateau de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

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Personnel RMN : Hélène Déméné, Philippe Barthe, Nathalie Sibille, Yinshan Yang

Matériels techniques

Bruker 800 MHz 4 canaux Sonde 15N-13C TCI TXI Avance III 2016 Passeur d'échantillons	Bruker 700 MHz 4 canaux 15N-13C  TCI + Haute pression TXI Avance III 2009	Bruker 600 MHz Sonde BBI + Haute pression Avance III 2009

Résonnance Magnétique Nucléaire RMN :

La RMN est une technique de spectroscopie basée sur les propriétés magnétiques de certains noyaux atomiques (¹H, ¹³C, ¹⁵N, ³¹P, ... ). L'échantillon placé dans un champ magnétique intense va être perturbé par des impulsions radiofréquence. L'enregistrement du retour à l'équilibre des spins permet d'avoir accès à l'environnement chimique des atomes. Ces informations offrent la possibilité d'analyses structurales et dynamiques ainsi que l'étude d'interactions impliquant des macromolécules biologiques.

Principales applications :

Etude type en RMN

o 1 : Objectif :

Proposer à la communauté scientifique française et européenne des possibilités d'analyse structurales et d'étude d'interaction par RMN pour des protéines et des oligonucléotides.

o 2 : Études d'interactions moléculaires

L'interaction moléculaire entre une macromolécule biologique et un petit ligand peut-être facilement suivie par RMN, en particulier dans le cas de constantes d'affinités faible de l'ordre de 1-1000 micromolaire. Cette étude peut aussi être réalisée sur une bibliothèque de ligands, dans la mesure ou la taille de la bibliothèque est faible (quelques dizaines maximum)
Un marquage isotopique 15N est requis pour cette étude.

L'étude par RMN est faite en haut-champ (700, 600 ou 500 MHz)

Spectres non attribués :
Après une étude de faisabilité, un spectre HSQC est réalisé pour chacun des partenaires potentiels. Le déplacement des signaux de la macromolécule est la signature de l'interaction. Chaque spectre consomme de l'ordre de 100 nanomole de molécule.
Spectres attribués :
L'attribution des spectres permet l'interprétation des résultats en termes structuraux, en particulier quand la structure de la molécule, ou d'un homologue, est déjà connue. Après une étude de faisabilité, un spectre HSQC est réalisé pour chacun des partenaires potentiels. Chaque spectre consomme de l'ordre de 100 nanomole de molécule. Le déplacement des signaux de la macromolécule est la signature de l'interaction, et l'attribution permet de déterminé quelles zones structurales de la macromolécule sont impliquées dans cette interaction.

o 3 : Attribution des spectres de biomolécules

L'attribution du spectres des molécules étudiées (peptides protéines, ADN, ARN) est une étape essentielle pour aller vers l'obtention d'informations structurales. Dans le cas de molécules dont la structure d'homologue est connue, l'attribution permet de vérifier si la molécule étudiée présente le même repliement, et permet d'affiner l'alignement structural.
Les techniques employées s'appuient sur le marquage isotopique en15N et 13C, et dépendent de la taille de la molécules étudiée. Une pré-étude est réalisée qui permet d'évaluer la qualité des spectres et la chance de mener à bien l'étude.
protéine<5 kDa :
Après une étude de faisabilité, le spectre 1H est attribué à partir d'une série d'expériences de RMN-2D : COSY, TOCSY, NOESY, ROESY, 13C-HSQC, 13C-HSQC-TOCSY qui ne nécessitent pas un marquage isotopique. Il est nécessaire pour cette étude de pouvoir atteindre des concentrations de l'ordre du 1mM. Environ 3 micromole de l'échantillon sont nécessaires pour les études de faisabilité et d'attribution.
entre 5 et 10 kDa :
Après une étude de faisabilité, les spectres sont attribués à partir d'une série d'expériences de RMN 2D et 3D double résonance : HSQC, TOCSY-HSQC, NOESY-HSQC qui nécessitent un marquage isotopique en 15N. Il est nécessaire pour cette étude de pouvoir atteindre des concentrations de l'ordre de 0.5mM à 1mM. Environ 1 micromole de l'échantillon sont nécessaires pour les études de faisabilité et d'attribution.
entre 10 et 20 kDa :
Après une étude de faisabilité, les spectres sont attribués à partir d'une série d'expériences de RMN 3D triple résonance : HNCA HNCO HNCACB HNCACO HN(CO)CA CBCA(CO)NH (HACA)CO(CA)NH qui nécessitent un double marquage isotopique en 15N et 13C. Il est nécessaire pour cette étude de pouvoir atteindre des concentrations de l'ordre de 0.5mM à 1mM. Environ 1 micromole de l'échantillon sont nécessaires pour les études de faisabilité et d'attribution.

o 4 : Détermination de structure de biomolécules :

Cette étape nécessite l'attribution préalable des signaux. La structure peut être déterminée par la collecte des données RMN de contraintes.

protéine <5 kDa :
A partir de l'attribution, un jeu de contraintes est extrait des spectres NOESY obtenus et le logiciel CYANA est utilisé pour déterminer la structure en solution de la molécule.

entre 5 et 10 kDa :
Un jeu d'expériences 2D et 3D complémentaires est réalisé : NOESY, TOCSY, TOCSY-HSQC, NOESY-HSQC et à partir de l'attribution, un jeu de contraintes est extrait des spectres obtenus et le logiciel CYANA est utilisé pour déterminer la structure en solution de la molécule.

entre 10 et 20 kDa :
Un jeu d'expériences complémentaires 2D, 3D et 4D est réalisé : NOESY, TOCSY, (h)CCH-tocsy, H(c)CH-tocsy, 15N-TOCSY-HSQC, 15N-NOESY-HSQC, 13C-NOESY-HSQC, HN-NOESY-CH.
A partir de l'attribution, un jeu de contraintes est extrait des spectres obtenus et le logiciel CYANA est utilisé pour déterminer la structure en solution de la molécule.

Microscopies Optiques

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Responsables techniques : Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. , Jean-Bernard Fiche

Matériels techniques

Etude type en Biophysique

o 1 : Objectif

Cette plateforme propose un ensemble d'approches basées sur la spectroscopie de fluorescence applicables à des études d'interactions entre biomolécules et de dynamique structurale (repliement, assemblage, diffusion, fluctuations, changements conformationnels). Contactez Emmanuel Margeat ou Caroline Clerte pour discuter des possibilités d'utilisation de la plateforme et de la conception des expériences.
Ci dessous une présentation des différentes techniques utilisées au CBS (bientôt disponible).

Plateforme Intégrée de Biophysique et de Biologie Structurale

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La Plateforme Intégrée de Biophysique et de Biologie Structurale (PIBBS), hébergée au sein du CBS (Centre de Biochimie Structurale), est composé de 9 plateaux dédiés à la biologie structurale intégrative. Elle a été labellisée plateforme RIO puis IBiSA. De plus, le CBS est intégré aux infrastructures nationales de biologie structurale FRISBI et d'imageries avancées FBI (financement dans le cadre du PIA).

La spécificité et le point fort de la plate-forme sont de rassembler dans une même structure des méthodes de biologies structurales (RMN, RX, ME, Bio / chemo-informatique) et des techniques de pointes de biophysique (AFM, microscopies optiques avancées en fluorescence). PIBBS offre une combinaison unique d'outils permettant la caractérisation structurale de macromolécules biologiques, de leur dynamique et de leurs associations.

- modélisation macromoléculaire et de complexes protéine-ligands,

- radiocristallographie à haute résolution (missions régulières au synchrotron),

- spectroscopie liquide par Résonance Magnétique Nucléaire cryo-microscopie et cryo-tomographie électronique

- microscopie à force atomique,

- microscopies de fluorescence (smFRET et suivi de particules uniques),

- spectroscopies de fluctuations de fluorescence (FCS et FCCS),

- pinces optiques et magnétiques,

- analyses SAXS

Si vous désirez faire appel à l'un de nos plateaux, contactez directement le responsable par mail. Les coordonnées des responsables sont affichées dans l'onglet plateau correspondant. Si vous avez des questions relatives au fonctionnement de la plateforme, veuillez contacter Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. (Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser.).

Caractérisation Biophysique

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Objectifs

Cette plateforme propose un ensemble de techniques permettant l'analyse d'échantillons protéiques. Les méthodes mises en œuvres permettent d'étudier :

- la monodispersité de l'échantillon.

- l'état de repliement de la protéine.

- les conformations présentes au sein de la protéine et leurs modifications en fonction de la température ou des conditions utilisées.

- les affinités entre molécules.

-La masse moléculaire des protéines et des complexes (protéine/protéine, protéine/Acides nucléiques) en solution, ainsi que la stoechiométrie de ces interactions.

Matériels et techniques

1 - Diffusion Dynamique de la lumière

La Diffusion Dynamique de la Lumière (DLS) est une technique spectroscopique qui permet d'obtenir le rayon hydrodynamique des molécules en solution. Cette information nous permet de déterminer le poids moléculaire apparent d'une protéine (si cette dernière est considérée comme une sphère). Les résultats obtenus nous permettent également de connaître l'état du repliement de la molécule étudiée ainsi que l'état de mono ou polydispersité de l'échantillon analysé.

DLS Zetasizer Nano-S (Malvern instrumentsTM)

2 – Dichroïsme Circulaire

Le Dichroïsme Circulaire (CD) permet d'obtenir des informations sur la structure secondaire des protéines, notamment la proportion de chaque conformation (hélices-alpha, feuillet -beta, coil, random coil...) présentes au sein de la protéine. Le CD permet de suivre le repliement ou la dénaturation de la protéine en fonction des conditions physicochimiques utilisées (température, tampon), les changements de conformations de la protéine en présence ou non de ligands.

CD Chirascan (Applied BiophysicsTM)

3 - Microcalorimétrie

La microcalorimétrie est basée sur la mesure de la chaleur émise ou absorbée lors de réactions impliquant notamment des interactions entre molécules ou lors de changements de conformation tels que le repliement des protéines.

La Titration Calorimétrique Isotherme (ITC) est utilisée pour étudier les facteurs influençant les interactions entre les molécules. Elle permet de déterminer les constantes de dissociation (KD) ainsi que la stoechiométrie de l'interaction. Elle donne également accès aux constantes thermodynamiques caractérisant l'interaction.

La Calorimétrie différentielle à Balayage (DSC) est une technique destinée à l'étude de la stabilité thermique des protéines et d'autres biomolécules. Elle   donne accès aux constantes thermodynamiques caractérisant la dénaturation et la température de dénaturation (Tm) de la molécule analysée.

4 – SEC –MALS

Cette technique permet la détermination du poids moléculaire des protéines et des complexes en solution. Elle comprend une chromatographie d'exclusion (SEC) couplée en ligne avec une mesure de l'absorbance UV, de la diffusion de la lumière laser (LS) et de l'indice de réfraction (RI).

Les protéines sont séparées par chromatographie d'exclusion, la lumière diffusée par les protéines est directement proportionnelle à leurs masses moléculaires et à leurs concentrations. Le SEC-MALS permet de définir la masse moléculaire absolue de la protéine ou du complexe analysé indépendamment de leur taille et de leur conformation. Cette technique permet donc, également, de déterminer les stoechiométries d'un complexe.

SEC –MALS : HPLC (AKTA purifier – GETM), Détecteur LS (miniDAWN TREOS – WayttTM), réfractométrie (Optilab T-rEX – WayttTM).