Structure, dynamique et fonction des biomolécules par RMN

Structure et dynamique des complexes nucléoprotéiques

Nos projets visent à apporter une vision quantitative et intégrative des mécanismes moléculaires de régulation de la transcription chez les bactéries en combinant des approches in vivo et in vitro.

 


Terminaison de la transcription procaryote

N. Declerck, E. Margeat, C. Clerté, R. Vishwakarma

Ce travail se concentre sur les deux mécanismes utilisés par les bactéries pour terminer la transcription d'un gène (terminaison intrinsèque et Rho dépendante)

Nous utilisons une combinaison de techniques de molécule unique (smFRET, SPTPALM et spectroscopies de corrélation), nano-manipulation et biologie structurale pour étudier la dynamique des événements conduisant à la terminaison de la transcription chez les bactéries. Plus précisément, nos recherches portent sur:

1. Les antiterminateurs LicT et SacY de Bacillus subtilis, des protéines qui empêchent l'arrêt prématuré de la transcription par liaison à une boucle d'ARN qui chevauche un terminateur intrinsèque.

2. Le terminateur de transcription Rho, un hexamère ATP-dépendant doté d'activités hélicase et translocase, impliqué dans la dissociation des complexes d'élongation de transcription.

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Cartoon representation of the LicT antitermination protein dimer, bound to its target RNA hairpin that has been labeled with a pair of fluorophores to monitor its conformational dynamics in a single pair FRET experiment.

Collaborations: H. Demene, F. Pedaci, M. Nollmann (CBS), M. Boudvillain (CBM, Orleans), N. Figueroa-Bossi (I2BC, Gif/Yvette), K. Brodolin (IRIM, Montpellier)

 


Adaptation des bactéries aux changements environnementaux

N. Declerck, A. Bourges, C. Clerté

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent l'adaptation des bactéries aux changements rapides de leur environnement. Nous cherchons notamment à confronter les résultats in vitro au comportement des protéines observées dans les cellules vivantes et les populations bactériennes.

Nous nous intéressons plus particulièrement aux répresseurs CggR et CcpN impliqués dans le contrôle de la glycolyse/néoglucogenèse chez B. subtilis. Des méthodes quantitatives très sensibles basées sur la mesure des fluctuations de fluorescence par microscopie bi-photonique nous permettent de déterminer la concentration intracellulaire, l'état d'oligomérisation et la diffusion de ces protéines régulatrices dans les cellules bactériennes vivantes. Combinées à des approches in vitro et in silico, nos travaux permettent d'établir un modèle de la réponse adaptative lors d'un changement de régime carboné. Une approche similaire est appliquée pour caractériser l'endonucléase Mrr responsable de l'activation de la réponse SOS dans les cellules E. coli exposées à de hautes pressions.

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Live cell imaging of a B. subtilis strain expressing a PccgR-GFP transcriptional fusion under repression on malate.

 

Collaborations: S. Aymerich (INRA, Jouy-en-Josas), C. Royer (RPI, NY), O. Radulescu (UM, Montpellier)

 


Nano-Ingénierie ADN

G. Bellot, E. Margeat, N. Aissaoui, A. Mills

Nous utilisons les propriétés d'auto-assemblage des molécules d'ADN pour construire des architectures 3D à une résolution nanométrique. Notre objectif est de développer de nouveaux systèmes intelligents bio-inspirés pour aider à résoudre des problèmes d'intérêt fondamental et médical.

Nanotechnologie à base d'ADN. L'origami ADN est la méthode de référence pour concevoir des formes arbitraires et dynamiques à partir de fragments d'ADN. Notre objectif principal est d'explorer de nouveaux principes d'auto-assemblage pour la fabrication de matériaux à base d'ADN de plus en plus sophistiqués.

Protéines membranaires. La compréhension des mécanismes moléculaires à la surface de la membrane cellulaire nécessite de nouveaux outils expérimentaux à l'échelle du nanométre. Nous développons des nanostructures d'ADN pour faciliter les études structurales des protéines membranaires par cryo-EM et par microscopie de fluorescence sur molécule unique.

Nanomécanique bio-inspirée. Inspiré par les caractéristiques biomécaniques des assemblages protéiques, notre objectif est de construire des structures ADN de taille nanométrique qui présentent des fonctions et mouvements contrôlables. Ces nano-dispositifs artificiels sont utilisés comme capteurs pour detecter des stimuli spécifiques avec des applications dans des domaines tels que la biodétection et la biophysique.

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DNA self-assembly of 3D nanostructures from 1.5 million of nucleobases.

 

Collaborations: Y. Ke, (Georgia Tech, USA), S. Granier (IGF, Montpellier), S. Bidault, (ESPCI, Paris).

Structure et dynamique des assemblages membranaires

Nous explorons la structure et la dynamique des assemblages membranaires, y compris les propriétés mécaniques, la structure et l'interaction des protéines membranaires, et les mécanismes de remodelage membranaire, sur des cellules vivantes ou des modèles de membranes artificielles, en utilisant des approches expérimentales à la molécule unique telles que la microcopie à force atomique (AFM) et de fluorescence / super résolution.

 


Remodelage et ségrégation des composants de la membrane

L. Costa, P.E. Milhiet, C. Bénistant, P. Dosset, C. Doucet, C. Godefroy, L. Fernandez

Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires des interactions lipide-protéine au sein des membranes et leur modulation spatio-temporelle dans différents contextes, en particulier le cancer et l'infection.

 

Structure et dynamique des tétraspanines. Les tétraspanines sont des protéines transmembranaires formant un réseau d'interactions protéine-protéine-lipide à la membrane plasmique des cellules eucaryotes. Elles sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires et associées à plusieurs maladies. En utilisant la microscopie de fluorescence en molécule unique et l'AFM, nous explorons la ségrégation latérale des tétraspanines en micro- ou nanodomaines. Nous étudions en particulier la dynamique et la ségrégation latérale du suppresseur de métastases CD82 et son rôle dans la migration cellulaire, ainsi que le rôle des tétraspanines CD9 et CD81 dans les cellules lors de l'infection par les virus HIV-1 et Influenza.

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Actin and paxillin labeling of micropatterned cells expressing CD82

Organisation des septines lors du remodelage membranaire. Les septines sont des protéines liant le GTP impliquées dans la compartimentation membranaire et le remodelage. Leur capacité à former des filaments fonctionnels dépend de leur liaison aux lipides PIP2. En utilisant des membranes modèles observées par microscopies AFM à haute vitesse et corrélatives AFM-fluorescence, nous explorons à l'échelle méso et nanométrique comment ces protéines polymérisent, recrutent les lipides et déforment les membranes biologiques.

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AFM micrograph of yeast septin imaged in air

Collaborations: E. Rubinstein (Villejuif), D. Levy (Institut Curie), F. Berditchevski (Birmingham, Royaume-Uni), O. Piétrement (Institut Gustave Roussy), G. Drin (IPMC, Nice), M. Mougel (IRIM, Montpellier), Sanofi-Pasteur.

 


Nanomécanique des métastases cancéreuses

C. Bénistant, L. Costa, C. Godefroy, P.E. Milhiet

 

Les propriétés physiques du microenvironnement des cellules cancéreuses jouent un rôle important dans la promotion des phénotypes invasifs des cellules et peuvent constituer un obstacle à l'accessibilité des thérapies. Nous analysons comment la biomécanique influe sur la formation et la progression du cancer en mesurant les propriétés mécaniques des cellules et des tissus cancéreux par AFM (spectroscopie de force et cartographie des forces).

 

Propriétés mécaniques des cancers colorectaux en transition vers les métastases. Nous mesurons et corrélons la rigidité (module d'Young) d'une banque de tissus de cancer colorectal avec les données de génomique et de survie des patients, en collaboration avec des cliniciens du Centre de Recherche sur le Cancer de Montpellier.

 

Fonctions du suppresseur de métastases CD82. CD82 régule plusieurs événements de remodelage de la membrane tels comme l'adhésion, la migration, l'endocytose ... par des mécanismes inconnus. En tant qu'organisateurs de membranes, les tétraspanines pourraient influencer la nano mécanique membranaire et nous testons l'influence de CD82 sur la tension membranaire, un paramètre clé dans le remodelage membranaire.

 

Collaborations: E. Crapez and A. Turtoi (IRCM, Montpellier)

 


Mécanismes de l'assemblage des pores nucléaires

C. Doucet, L. Costa, P. Dosset, P.E. Milhiet, A. Vial

Les pores nucléaires (PNs) sont les seules passerelles entre le noyau et le cytoplasme. Dans les cellules en division, le nombre de PNs double pendant l'interphase. L'insertion de nouveaux pores dans l'enveloppe nucléaire nécessite la fusion locale des membranes nucléaires internes et externes. Cela implique une coordination parfaite entre le remodelage membranaire et le recrutement et l'assemblage des nucléoporines. Nous cherchons à comprendre les mécanismes impliqués dans les premières étapes de la formation des PNs en interphase, en particulier la déformation de la membrane nucléaire selon 2 axes principaux:

 

1. Identifier l'implication séquentielle des acteurs moléculaires dans la déformation de la membrane. Nous combinons l'AFM et la microscopie de localisation de la molécule uniquesur des noyaux isolés, pour corréler le recrutement de protéines spécifiques avecla déformation de la membrane nucléaire et l'assemblage des pores.

 

2. Comprendre la déformation particulière de l'enveloppe nucléaire. Les protéines potentiellement impliquées dans le remodellage de la membrane du pore nucléaire induisent des déformations convexes sur des liposomes synthétiques alors que les intermédiaires de formation des pores sont concaves. Nous étudions les spécificités de la membrane nucléaire conduisant à ces différences.

 

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Correlative AFM and fluorescence microscopy

 


Dynamique structurale des récepteurs métabotropiques du glutamate

E. Margeat, C. Clerté, R. Quast

 

En utilisant une combinaison de méthodes avancées de microscopie sur molécules uniques, nous étudions le mécanisme d'activation des récepteurs couplés aux protéines G.

 

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont des membres de la classe C des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Chaque sous-unité est composée d'un domaine extracellulaire qui se lie aux ligands orthostériques tels que le glutamate, et d'un domaine à sept hélices transmembranaires responsable de l'activation de la protéine G. Nous étudions la dynamique structurale de mGluR par une combinaison de marquage site-spécifique d'acides aminés non naturel, purification et solubilisation des récepteurs, et FRET sur molécules uniques couplé à la avec de la détection de fluorescence multiparamétriques (MFD).

 

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Cartoon representation of a metabotropic glutamate receptor dimer in a lipid bilayer

 

 

Collaborations: J.P. Pin (IGF, Montpellier), C. Seidel (Düsseldorf, Allemagne), D. Levy, M. Dahan (Institut Curie, Paris)

 


Développements méthodologiques

L. Costa, E. Margeat, P.E. Milhiet, C. Clerté

 

Notre recherche nécessite le développement de nouvelles approches méthodologiques dans les domaines de la microcopie et spectroscopie de fluorescence et de la microscopie à force atomique, telles que:

 

. Microscopie corrélative à force atomique et de fluorescence super-résolue
. Microscopies en champ proche sans contact basées sur la mesure de FRET
. Microscopies de fluctuation de fluorescence à un et deux photons
. Spectroscopie de corrélation de fluorescence couplée à la rhéométrie
. Structures photoniques pour mesures de FRET sur molécules uniques

 

Collaborations: M. Nollmann, M. Abkarian (CBS), T. Ando (Kanazawa, Japon), C. Seidel (Düsseldorf, Allemagne), J. Wenger (Institut Fresnel, Marseille), E. Lesniewska (Institut Carnot, Dijon)

 

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