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Cyro-tomographie sur cellules entières

Les conditions de mise en culture directement sur grille de microscopie électronique de différents types cellulaires ont été définies et optimisées. De même, les conditions de congélation ont été adaptée à chaque cas. En parallèle, nous avons d’une part définis le protocole d’ajout de billes d’or (marqueurs fiduciaires) sur les cellules avant congélation et d’autre part les conditions d’acquisition de séries d’images inclinées à faible dose d’électron. Cette technique, appelée cryo-tomographie nous permet d’accéder à l’organisation moléculaire des cellules à proximité des membranes plasmiques.

Cryo-microscopie sur cellules entières infectées

Un protocole de fixation a été établi et validé afin de sortir des cellules infectées du L3 du CPBS (Centre d’études d’agents pathogènes et biotechnologies pour la santé, Montpellier) (VIH, Chikungunya). Compte tenu de la résolution que la tomographie nous permet d’atteindre (2 à 10 nm), la fixation chimique n’affecte pas l’aspect des cellules. Il devient alors possible de visualiser directement les virus dans les cellules ou au contact des cellules.

Cryo-CLEM (cryo-correlative light and electron microscopy)

La difficulté principale lorsque l’on désire étudier des complexes biologiques dans les cellules, est de pouvoir les localiser avec précision afin d’effectuer l’acquisition des séries d’images inclinées au niveau des zones d’intérêts identifiées. Pour cela, nous développons la cryo-CLEM. Les molécules d’intérêts sont couplées avec des molécules fluorescentes comme la GFP. Une fois congelées, les cellules sont observées à l’aide d’un microscope droit équipé pour la fluorescence et disposant d’une platine cryo permettant le maintient des grilles à la température de l’azote liquide. Dans ce cadre, nous nous sommes équipés d’un prototype de la société Linkam.