Plateforme Intégrée de Biologie Structurale

Plateau de Biocristallographie (RX)

 

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Matériels techniques

 

Etude type en cristallographie

 

o 1 : Objectif

Proposer à la communauté scientifique internationale des possibilités d'analyse structurales et d'étude d'interaction par cristallographie pour des protéines et des oligonucléotides.

 

o 2 : Cristallogenese

Nous avons la possibilité de tester plus de 2300 conditions initiales différentes de cristallisation réparties dans 23 kits (Deep Well au format 96), complétés par 4 kits de détergents (4 x 96) et 3 kits d'additifs (3 x 96) pour affinement. Les techniques de  cristallisation sont essentiellement de la diffusion de vapeur (gouttes assises ou suspendues) mais également liquide-liquide ou sous huile.

 

 

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Chaque piste est affinée (conditions initiales, additifs) avec  le robot Hamilton (format 96)  ou manuellement (format 15 ou 24)

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Selon la quantité de protéine, il est possible de réaliser les tests de cristallisations sur des gouttes de 1 à 0.1 µl par condition. Une étude complète (11 kits) peut être achevée avec environ 150 µl de protéine (pure sur gel SDS-page) à une concentration (en moyenne) de 10 mg/ml. Cette concentration initiale est susceptible d'être ajustée (entre 5 et 20 mg/ml) en fonction de la solubilité de la protéine (rapport gouttes précipitées sur gouttes claires) après le premier kit. Au terme de ces 11 kits, trois possibilités ;

- Nous avons un mono cristal d'une taille suffisante pour être manipulé (20 µm), un test de diffraction est alors réalisé au laboratoire. La suite (collecte,  résolution de structure) est dépendante de la qualité diffractive du cristal. Si un cristal diffractant correctement est obtenu au laboratoire (résolution d'au moins 3.5 A), une collecte complète de données sera effectuée au laboratoire et à l'ESRF (synchrotron européen à Grenoble).

- Pas de cristaux analysables mais quelques pistes (cristaux maclés ou trop petits, précipités cristallins, oursins, aiguilles...). Dans ce cas, nous tentons une optimisation à partir de chaque condition initiale. Ceci est réalisé avec deux kits d'additifs (1, 2) et un kit de 96 détergents . En parallèle, la méthode de microseeding sera testée à partir des différentes pistes (T. Walter et al. Acta Cryst. F, 2008) ainsi qu'à partir des kits généraux (A. D'Arcy et al. Acta Cryst. D, 2007).

- Pas de cristaux ni de pistes. Une réunion avec les parties concernées est alors à envisager pour évoquer le besoin d'analyse de la protéine (polydispersité, protéolyse ménagée si multi domaines ou destructuration partielle...) ou opter pour une résolution par RMN si le poids de la protéine est inférieur à 40 kD

Le protocole général d'une étude est schématisé sur la figure suivante :

 

 

 

o 3 : Détermination de la structure

La détermination de la structure ne sera engagée qu'après l'obtention d'un jeu complet de données à une résolution d'au moins 3,5 A. Succinctement, la structure sera résolue soit par :


- Remplacement moléculaire si une structure d'une protéine homologue existe (recherchée par bioinformatique).


- Remplacement isomorphe ou diffusion anomale (selon l'élément) en utilisant des dérivés d'atome lourd obtenus soit in vivo (séléno-méthionine, séléno- cystéine) soit par trempage des cristaux avec une solution d'atome lourd (Hg,Pt..)


- Méthode directe si la résolution est > à  1.2 A (extrêmement rare).

 

 

 

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