Observation directe et simultanée de la transcription et de l'architecture des chromosomes dans les cellules individuelles avec Hi-M

Andrés M. Cardozo Gizzi, Sergio M. Espinola, Julian Gurgo, Christophe Houbron, Jean-Bernard Fiche, Diego I. Cattoni, Marcelo Nollmann

L'observation simultanée de l'organisation et de la transcription de la chromatine en 3D au niveau d'une seule cellule et avec une haute résolution spatiale pourrait détenir la clé pour dévoiler les mécanismes régulant le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et même la maladie. Nous avons récemment développé Hi-M, une technologie qui permet le marquage séquentiel, l'imagerie 3D et la localisation de multiples loci d'ADN génomique ainsi que l'expression d'ARN dans des cellules uniques au sein d'embryons entiers et intacts de drosophile. Il est important de noter que la technologie Hi-M permet de détecter simultanément l'expression de l'ARN et l'organisation des chromosomes sans avoir à démonter l'échantillon et à réhybrider la sonde primaire. Nous présentons ici un protocole étape par étape décrivant la conception des sondes, la préparation des échantillons, l'immobilisation stable des embryons dans des chambres microfluidiques et la procédure complète d'acquisition des images. La procédure d'hybridation combinée de fluorescence in situ d'ARN/ADN prend 4 à 5 jours, y compris la collecte des embryons. En outre, nous décrivons un logiciel d'analyse d'images pour segmenter les noyaux, détecter les taches génomiques, corriger la dérive et produire des matrices Hi-M. Une expérience Hi-M typique prend 1 à 2 jours pour compléter toutes les étapes de marquage et d'imagerie et 4 jours supplémentaires pour l'analyse des images. Cette technologie peut être facilement étendue pour étudier la différenciation des cellules en culture ou l'organisation de la chromatine dans des tissus complexes.

Nat Protoc 2020 Mar;15(3):840-876. doi: 10.1038/s41596-019-0269-9

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