Structure and Dynamics of Nucleoproteic and Membrane Assemblies

Plateau de Bio-informatique (BIOINFO)

 

Responsable scientifique à contacter : This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Responsable technique : Jean-Luc Pons

 

Materiels techniques

 

étude type en Bio-informatique

 

o 1 : Analyses prédictives des structures primaires

Une série d'analyses à partir de la séquence de la protéine d'intérêt (et de ses homologues) sera effectuée pour notamment connaître l'existence potentielle de domaines fonctionnels et structuraux, de segments transmembranaires. Les caractéristiques biophysiques macroscopiques (masse moléculaire, pI, ...), mais aussi les biais de compositions en acides aminés ou la présence de certains résidus importants pour les caractérisations expérimentales (méthionines, cystéines, tryptophanes, ...) seront déterminées.

Utilisation d'un méta-serveur spécifique, développé par J. Gracy : PAT (http://pat.cbs.cnrs.fr)

o 2 : Modélisation macromoléculaire

Différents protocoles seront à envisager en cascades suivant les résultats obtenus à chaque étape et la difficulté attendue aux étapes suivantes : comparaisons séquences-structures, prédiction du site actif, construction de modèles complets, détermination des ligands potentiels, évaluation et raffinement. Ces différentes étapes seront éffectuées à l'aide du serveur @TOME (http://atome.cbs.cnrs.fr)

A basse identite de sequence (15-25%) : A discuter avec les coordinateurs

A haute identite de sequence (> 25%) : A priori automatique. avec @TOME

 

Plateau de Biophysique (Biophys)

 

Responsable scientifique à contacter : This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Responsables techniques : This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. , Jean-Bernard Fiche

 

Matériels techniques

 

Etude type en Biophysique

o 1 : Objectif

Cette plateforme propose un ensemble d'approches basées sur la spectroscopie de fluorescence applicables à des études d'interactions entre biomolécules et de dynamique structurale (repliement, assemblage, diffusion, fluctuations, changements conformationnels). Contactez Emmanuel Margeat ou Caroline Clerte pour discuter des possibilités d'utilisation de la plateforme et de la conception des expériences.
Ci dessous une présentation des différentes techniques utilisées au CBS (bientôt disponible).

Plateau de microscopie en champ proche (AFM)

Scientific manager : This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

Technical manager: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Instruments and techniques:

instrument1 instrument2 instrument3
 JPK Nanowizard 4 coupled to Super Resolution Fluorescence Microscopy
 
 JPK Nanowizard coupled to Epifluorescence Microscopy
 
 High-Speed Atomic Force Microscope
(Developed in collaboration with Pr.Toshio Ando)
 
instrument4 instrument5 instrument6
 Bruker Multimode Nanoscope VIII
 
 
 Bruker multimode Nanoscope III
 
 
 X-Ray-AFM that can be installed in Synchrotron X-Ray beamlines. Equiped with complete Nanonis SPECS control unit.

Atomic Force Microscopy (AFM):
The technique allows characterizing sample morphology at nanoscale. Images are acquired by scanning a nanometric tip in gentle contact or intermittent contact with the sample. The tip is positioned at the end of a micrometric force transducer, the AFM cantilever: it records the variation of sample topography due to changes of tip-sample interaction during scanning operation. In addition, by measuring the tip-sample interaction force as a function of the tip-sample distance, AFMs can evaluate sample elastic and viscous properties.

Objectives:

  • Characterize biological samples topography at nanoscale in dry or liquid environment. Image acquisition can be performed in static or dynamic modes.
cholera1  cholera2 

Cholera Toxin B-oligomers (left) bound to GM1 domains within a DOPC-DPPC (1:1) model membrane (right) as observed by AFM. Milhiet, Pierre Emmanuel, et al. "AFM characterization of model rafts in supported bilayers." Single molecules 2.2 (2001): 109-112.

 

  • Correlate biomolecules activity observed by Fluorescence (Epi and TIRF) or Super Resolution Microscopy (PALM/STORM) with the associated sample topology observed by AFM. Our two fluorescence-AFM correlative setups are mounted on top of Zeiss inverted microscopes. Fast AFM imaging (1 frame in few seconds) can be performed simultaneously with the fluorescence microscopy operation.

figure corrigee

Amphiphatic Lipid Packing Sensors (ALPS, left), and DOPE (Rhodamin marked, center) TIRF image correlated with the AFM image of the model membrane + biomolecules on the right. Scan size = 10 µm.

 

  • Real-time visualization of biomolecules activity at high spatial-temporal resolution by High-Speed AFM (HS-AFM). Our HS-AFM can acquire AFM images up to 10 images/seconds, allowing for dynamic tracking of slow biomolecules activity.

protofibril

Elongation of single protofibril (white arrows) is shown in time lapses. Deciphering the Structure, Growth and Assembly of Amyloid-Like Fibrils Using High-Speed Atomic Force Microscopy. Milhiet, P. E., Yamamoto, D., Berthoumieu, O., Dosset, P., Le Grimellec, C., Verdier, J. M., ... & Ando, T. (2010). PLoS One, 5(10), e13240. Speed = 1 image/second.

 

  • Evaluation of mechanical properties of biomolecules and cells. Making use of the AFM tip as a nanometric indenter, we can characterize the extrinsic and, if possible, the intrinsic rigidity of materials with high spatial resolution.
DOPC1  DOPC2 

Left: DOPC-DPPC (1:1) model membrane morphology. Right: corresponding Young modulus evaluated modeling the tip-sample mechanical contact with the Hertz theory.

 

Software and analysis:


We make use of both commercial and entirely/partial custom-made software to control our instruments. Data analysis is performed both with C++/Matlab home-made programs as well as with open source software such as ImageJ and Gwyddion or software provided by manufacturers.

Plateforme Intégrée de Biophysique et de Biologie Structurale

logo PIBBS

 

La Plateforme Intégrée de Biophysique et de Biologie Structurale (PIBBS), hébergée au sein du CBS (Centre de Biochimie Structurale), est composé de 9 plateaux dédiés à la biologie structurale intégrative. Elle a été labellisée plateforme RIO puis IBiSA. De plus, le CBS est intégré aux infrastructures nationales de biologie structurale FRISBI et d'imageries avancées FBI (financement dans le cadre du PIA).

La spécificité et le point fort de la plate-forme sont de rassembler dans une même structure des méthodes de biologies structurales (RMN, RX, ME, Bio / chemo-informatique) et des techniques de pointes de biophysique (AFM, microscopies optiques avancées en fluorescence). PIBBS offre une combinaison unique d'outils permettant la caractérisation structurale de macromolécules biologiques, de leur dynamique et de leurs associations.

- modélisation macromoléculaire et de complexes protéine-ligands,

- radiocristallographie à haute résolution (missions régulières au synchrotron),

- spectroscopie liquide par Résonance Magnétique Nucléaire cryo-microscopie et cryo-tomographie électronique

- microscopie à force atomique,

- microscopies de fluorescence (smFRET et suivi de particules uniques),

- spectroscopies de fluctuations de fluorescence (FCS et FCCS),

- pinces optiques et magnétiques,

- analyses SAXS

Si vous désirez faire appel à l'un de nos plateaux, contactez directement le responsable par mail. Les coordonnées des responsables sont affichées dans l'onglet plateau correspondant. Si vous avez des questions relatives au fonctionnement de la plateforme, veuillez contacter This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it. (This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.).

Plateau de microscopie électronique (ME)

 

Responsable scientifique à contacter : This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.

 

Responsables techniques : Joséphine Lai-Kee-Him

 

Materiels techniques

 

Etude type en microscopie

 

o Objectifs

Proposer à la communauté scientifique internationale des possibilités d'analyse structurales et d'étude d'interaction par cryo microscopie électronique et (cryo) tomographie électronique.

 

o Analyse structurale de particules isolées hydratées-congelées

1- Observation après coloration négative de l'échantillon et évaluation de sa qualité

But :
analyser la concentration et l'homogénéité de l'échantillon
construire un modèle initial par traitement d'image

2- Congélation et observation des échantillons hydratés-congelés

But : acquisition d'images des échantillons congelés

3- Analyse et traitement d'images

But : analyse 2D et/ou reconstruction 3D de l'échantillon/objet observé

Suivant le niveau de détail (résolution) que l'on désire atteindre, il est nécessaire de traiter plusieurs centaines (voir milliers) d'images acquises au microscope

 

o (Cryo) Tomographie électronique

Échantillons : il est possible d'effectuer des études en tomographie électronique sur des échantillons colorés, des coupes ou sur des échantillons hydratés-congelés.

Acquisition de séries d'images d'échantillon inclinées dans le microscope de -60° à +60°

Analyse et reconstruction

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