Plateforme Intégrée de Biophysique et de Biologie Structurale

Caractérisation Biophysique

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Objectifs

Cette plateforme propose un ensemble de techniques permettant l'analyse d'échantillons protéiques. Les méthodes mises en œuvres permettent d'étudier :

- la monodispersité de l'échantillon.

- l'état de repliement de la protéine.

- les conformations présentes au sein de la protéine et leurs modifications en fonction de la température ou des conditions utilisées.

- les affinités entre molécules.

-La masse moléculaire des protéines et des complexes (protéine/protéine, protéine/Acides nucléiques) en solution, ainsi que la stoechiométrie de ces interactions.

 

Matériels et techniques

1 - Diffusion Dynamique de la lumière

La Diffusion Dynamique de la Lumière (DLS) est une technique spectroscopique qui permet d'obtenir le rayon hydrodynamique des molécules en solution. Cette information nous permet de déterminer le poids moléculaire apparent d'une protéine (si cette dernière est considérée comme une sphère). Les résultats obtenus nous permettent également de connaître l'état du repliement de la molécule étudiée ainsi que l'état de mono ou polydispersité de l'échantillon analysé.

DLS

DLS Zetasizer Nano-S (Malvern instrumentsTM)

2 – Dichroïsme Circulaire

Le Dichroïsme Circulaire (CD) permet d'obtenir des informations sur la structure secondaire des protéines, notamment la proportion de chaque conformation (hélices-alpha, feuillet -beta, coil, random coil...) présentes au sein de la protéine. Le CD permet de suivre le repliement ou la dénaturation de la protéine en fonction des conditions physicochimiques utilisées (température, tampon), les changements de conformations de la protéine en présence ou non de ligands.

CD

CD Chirascan (Applied BiophysicsTM)

3 - Microcalorimétrie

La microcalorimétrie est basée sur la mesure de la chaleur émise ou absorbée lors de réactions impliquant notamment des interactions entre molécules ou lors de changements de conformation tels que le repliement des protéines.

La Titration Calorimétrique Isotherme (ITC) est utilisée pour étudier les facteurs influençant les interactions entre les molécules. Elle permet de déterminer les constantes de dissociation (KD) ainsi que la stoechiométrie de l'interaction. Elle donne également accès aux constantes thermodynamiques caractérisant l'interaction.

La Calorimétrie différentielle à Balayage (DSC) est une technique destinée à l'étude de la stabilité thermique des protéines et d'autres biomolécules. Elle   donne accès aux constantes thermodynamiques caractérisant la dénaturation et la température de dénaturation (Tm) de la molécule analysée.

4 – SEC –MALS

Cette technique permet la détermination du poids moléculaire des protéines et des complexes en solution. Elle comprend une chromatographie d'exclusion (SEC) couplée en ligne avec une mesure de l'absorbance UV, de la diffusion de la lumière laser (LS) et de l'indice de réfraction (RI).

Les protéines sont séparées par chromatographie d'exclusion, la lumière diffusée par les protéines est directement proportionnelle à leurs masses moléculaires et à leurs concentrations. Le SEC-MALS permet de définir la masse moléculaire absolue de la protéine ou du complexe analysé indépendamment de leur taille et de leur conformation. Cette technique permet donc, également, de déterminer les stoechiométries d'un complexe.

SEC-MALS

SEC –MALS : HPLC (AKTA purifier – GETM), Détecteur LS (miniDAWN TREOS – WayttTM), réfractométrie (Optilab T-rEX – WayttTM).

 

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